ПТР реакцияларындағы интерференциялық факторлар

ПТР реакциясы кезінде кейбір кедергі жасайтын факторлар жиі кездеседі.
ПТР сезімталдығы өте жоғары болғандықтан, ластану ПТР нәтижелеріне әсер ететін ең маңызды факторлардың бірі болып саналады және жалған оң нәтижелер беруі мүмкін.
Жалған-теріс нәтижелерге әкелетін әртүрлі көздер бірдей маңызды. Егер ПТР қоспасының бір немесе бірнеше маңызды бөліктері немесе күшейту реакциясының өзі тежелсе немесе кедергі болса, диагностикалық талдауға кедергі болуы мүмкін. Бұл тиімділіктің төмендеуіне және тіпті жалған теріс нәтижелерге әкелуі мүмкін.
Ингибирлеуден басқа, үлгіні дайындағанға дейін тасымалдау және/немесе сақтау шарттарына байланысты мақсатты нуклеин қышқылының тұтастығы жоғалуы мүмкін. Атап айтқанда, жоғары температура немесе жеткіліксіз сақтау жасушалар мен нуклеин қышқылдарының зақымдалуына әкелуі мүмкін. Жасуша мен тіндерді бекіту және парафинді ендіру ДНҚ фрагментациясының және тұрақты проблеманың белгілі себептері болып табылады (1 және 2-суреттерді қараңыз). Бұл жағдайларда тіпті оңтайлы оқшаулау және тазарту көмектеспейді.

1-сурет | Иммобилизацияның ДНҚ тұтастығына әсері
Агарозды гель электрофорезі аутопсияның парафинді бөліктерінен бөлінген ДНҚ сапасы айтарлықтай өзгеретінін көрсетті. Фиксация әдісіне байланысты сығындыларда әртүрлі орташа фрагмент ұзындықтағы ДНҚ болды. ДНҚ табиғи мұздатылған үлгілерде және буферленген бейтарап формалинде бекітілгенде ғана сақталды. Қатты қышқыл Буин фиксаторын немесе буферленбеген, құрамында құмырсқа қышқылы бар формалинді пайдалану ДНҚ-ның айтарлықтай жоғалуына әкелді. Қалған фракция өте фрагменттелген.
Сол жақта фрагменттердің ұзындығы килобаза жұптарымен (кбит) көрсетілген

2-сурет | Нуклеин қышқылының нысаналарының тұтастығын жоғалту
(a) Екі жіптегі 3′-5′ саңылау мақсатты ДНҚ-ның үзілуіне әкеледі. ДНҚ синтезі әлі де шағын фрагментте болады. Дегенмен, егер ДНҚ фрагментінде праймерді жасыту орны жоқ болса, тек сызықтық күшейту орын алады. Ең қолайлы жағдайда фрагменттер бір-бірін қанықтыруы мүмкін, бірақ кірістілік аз болады және анықтау деңгейінен төмен болады.
б) Негізінен депуриндеу мен тимидин димерінің түзілуіне байланысты негіздердің жоғалуы Н-байланыстар санының азаюына және Тм-нің төмендеуіне әкеледі. Ұзартылған жылыну фазасында праймерлер матрицалық ДНҚ-дан еріп кетеді және тіпті азырақ қатаң жағдайларда да жасытпайды.
(c) Көршілес тиминдік негіздер ТТ димерін құрайды.
Молекулярлық диагностикада жиі кездесетін тағы бір жалпы мәселе – фенол-хлороформды экстракциямен салыстырғанда мақсатты нуклеин қышқылдарының оңтайлы емес шығарылуы. Төтенше жағдайларда бұл жалған негативтермен байланысты болуы мүмкін. Қайнаған лизис немесе жасуша қалдықтарын ферментативті қорыту арқылы көп уақытты үнемдеуге болады, бірақ бұл әдіс нуклеин қышқылының жеткіліксіз бөлінуіне байланысты ПТР сезімталдығының төмен болуына әкеледі.

Күшейту кезінде полимераза белсенділігінің тежелуі

Жалпы алғанда, тежелу ПТР-ның оңтайлы емес нәтижелеріне әкелетін барлық факторларды сипаттау үшін контейнерлік тұжырымдама ретінде пайдаланылады. Қатаң биохимиялық мағынада тежелу ферменттің белсенділігімен шектеледі, яғни ДНҚ-полимеразаның белсенді аймағымен немесе оның кофакторымен (мысалы, Taq ДНҚ полимеразасы үшін Mg2+) әрекеттесу арқылы субстрат-өнім конверсиясын төмендетеді немесе болдырмайды.
Үлгідегі құрамдас бөліктер немесе реагенттері бар әртүрлі буферлер мен сығындылар ферментті тікелей тежей алады немесе оның кофакторларын (мысалы, ЭДТА) ұстап алады, осылайша полимеразаны инактивациялайды және өз кезегінде ПТР нәтижелерінің төмендеуіне немесе жалған теріс болуына әкеледі.
Дегенмен, реакция компоненттері мен мақсатты құрамды нуклеин қышқылдары арасындағы көптеген өзара әрекеттесулер де «ПТР ингибиторлары» ретінде белгіленеді. Оқшаулау арқылы жасушаның тұтастығы бұзылып, нуклеин қышқылы босатылғаннан кейін үлгі мен оның айналасындағы ерітінді мен қатты фаза арасында өзара әрекеттесу пайда болуы мүмкін. Мысалы, «тұтқыштар» ковалентті емес өзара әрекеттесу арқылы бір немесе екі тізбекті ДНҚ-ны байланыстыра алады және ақырында ПТР реакциясының ыдысына жететін нысаналардың санын азайту арқылы оқшаулау мен тазартуға кедергі келтіруі мүмкін.
Жалпы алғанда, ПТР ингибиторлары көптеген дене сұйықтықтарында және клиникалық диагностикалық сынақтар үшін қолданылатын реагенттерде (зәрдегі мочевина, гемоглобин және қандағы гепарин), тағамдық қоспаларда (органикалық компоненттер, гликоген, май, Са2+ иондары) және қоршаған ортадағы компоненттерде (фенолдарда) болады. , ауыр металдар)

Неғұрлым кең таралған ПТР ингибиторларын бактериялар мен эукариоттық жасушаларда, мақсатты емес ДНҚ-да, тіндік матрицалардың ДНҚ-байланыстырушы макромолекулаларында және қолғаптар мен пластмассалар сияқты зертханалық жабдықтарда табуға болады. Экстракция кезінде немесе одан кейін нуклеин қышқылдарын тазарту ПТР тежегіштерін жоюдың қолайлы әдісі болып табылады.
Бүгінгі таңда әртүрлі автоматтандырылған экстракция жабдығы көптеген қолмен хаттамаларды алмастыра алады, бірақ мақсатты 100% қалпына келтіру және/немесе тазарту ешқашан қол жеткізілмеді. Потенциалды ингибиторлар тазартылған нуклеин қышқылдарында әлі де болуы мүмкін немесе әлдеқашан күшіне енген болуы мүмкін. Тежегіштердің әсерін азайту үшін әртүрлі стратегиялар бар. Тиісті полимеразаны таңдау ингибиторлардың белсенділігіне айтарлықтай әсер етуі мүмкін. ПТР тежелуін төмендетудің басқа дәлелденген әдістері полимераз концентрациясын арттыру немесе BSA сияқты қоспаларды қолдану болып табылады.
ПТР реакцияларының тежелуін ішкі процесс сапасын бақылауды (IPC) қолдану арқылы көрсетуге болады.
Этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол және фенол сияқты экстракция жинағындағы барлық реагенттер мен басқа ерітінділерді нуклеин қышқылының изолятынан мұқият жуу қадамымен алып тастауды қадағалау керек. Олардың концентрациясына байланысты олар ПТР-ны белсендіруі немесе тежеуі мүмкін.