ПТР реакцияларындағы кедергілер факторлары

ПТР реакциясы кезінде кейбір кедергілер жиі кездеседі.
ПТР-нің өте жоғары сезімталдығына байланысты ластану PCR нәтижелеріне әсер ететін маңызды факторлардың бірі болып саналады және жалған оң нәтиже береді.
Жалған-теріс нәтижелерге әкелетін әртүрлі көздер бірдей маңызды. Егер ПТР қоспасының бір немесе бірнеше маңызды бөліктері немесе күшейту реакциясының өзі кедергі келтірсе немесе араласады, диагностикалық талдауға кедергі келтіруі мүмкін. Бұл тиімділіктің төмендеуіне және тіпті жалған теріс нәтижелерге әкелуі мүмкін.
Тегістеуге қосымша, мақсатты нуклеин қышқылының жоғалуы үлгіні дайындауға дейін жеткізу және / немесе сақтау шарттарының салдарынан болуы мүмкін. Атап айтқанда, жоғары температура немесе жеткіліксіз сақтау жасушалар мен нуклеин қышқылдарының зақымдалуына әкелуі мүмкін. Ұяшықтар мен ұлпаны бекіту және парафинді ендіру ДНҚ-ның фрагментациясының және тұрақты проблеманың белгілі себептері (1 және 2 суреттерді қараңыз). Мұндай жағдайларда тіпті оңтайлы оқшаулау және тазарту көмектеспейді.

1-сурет | ДНҚ тұтастығына иммобилизацияның әсері
Агароза гель электрофорезі көрсеткендей, Autopsies парафин секцияларынан оқшауланған ДНҚ сапасы айтарлықтай өзгерді. Әр түрлі фрагмент ұзындығының ДНҚ бекіту әдісіне байланысты сығындыларда болды. ДНҚ-ны бұтаның мұздатылған сынамаларында және буферальды бейтарап формалиндерде сақталған кезде ғана сақталған. Қышқыл қышқылданған немесе оралмайтын, құрамында қышқылданбаған, формальды қышқылдан жасалған формалинді қолдану ДНҚ-ның айтарлықтай жоғалуына әкелді. Қалған бөлшек өте бөлінген.
Сол жақта фрагменттер ұзындығы килобаза жұптарында (KBP) көрінеді

Сурет 2 | Нуклеин қышқылы нысандарының тұтастығын жоғалту
(a) Екі жіптердегі 3'-5 'алшақтық мақсатты ДНҚ-да үзіліске әкеледі. ДНҚ-ны синтездеу әлі де кішкене фрагментте пайда болады. Алайда, егер ДНҚ-ның фрагментінде праймерді емдейтін сайт жоқ болса, тек сызықтық күшейту орын алады. Ең қолайлы жағдайда фрагменттер бір-бірін қалпына келтіре алады, бірақ кірістіліктер аз және төмен түседі.
(b) негізінен, негізінен, дейді дейді және тимидинді түзілуіне байланысты базалардың жоғалуы, H-облигациялар санының азаюына және ТМ-нің төмендеуіне әкеледі. Ұзартылған жылыну кезеңінде праймерлер матрицалық ДНҚ-дан алшақтайды және аз қатаң жағдайларда да, оны қолданбайды.
(c) Көршілес тиминдік негіздер TT Digmer құрайды.
Молекулалық диагностикада жиі кездесетін тағы бір жалпы мәселе - фенол-хлороформ өндірумен салыстырғанда нысаналы нуклеин қышқылдарын оңтайлы шығарудан аз. Төтенше жағдайларда бұл жалған негативтермен байланысты болуы мүмкін. Көп уақытты қайнатуға болады, қайнаған лизис немесе жасуша қоқыстарының ферментативті ас қорытуымен үнемдеуге болады, бірақ бұл әдіс нуклеин қышқылы жеткіліксіз болғандықтан жиі ПТР сезімталдығына әкеледі.

Күшейту кезінде полимеразиялық белсенділіктің тежелуі

Жалпы, ингибирлеу контейнер тұжырымдамасы ретінде пайдаланылады, бұл субоптикалық ПТР нәтижелеріне әкелетін барлық факторларды сипаттайды. Қатаң биохимиялық мағынада ингибирлеу ферменттің белсенділігімен шектеледі, яғни ДНҚ полимеразасының белсенді сайтымен немесе оның коэффициенті (мысалы, MG2 + TAQ DNA Polymerase үшін MG2 +).
Үлгідегі немесе әртүрлі реагенттердегі компоненттер және құрамында әр түрлі буферлер мен сығындылар ферменттерді тікелей тежеуге немесе оның коэффикторларын тікелей кедергі келтіруі немесе оның коэффициенттеріне (мысалы, EDTA) ұстап алады, осылайша полимеразаны және бұрыс кез-келген уақытта немесе жағымсыз ПТР нәтижелеріне әкеледі.
Алайда, реакция компоненттері мен құрамдас-реактивті құрамдас қышқылдар арасындағы көптеген өзара әрекеттесулер «ПТР ингибиторлары» деп белгіленеді. Жасушаның тұтастығы оқшаулану арқылы бұзылады және нуклеин қышқылы шығарылады, үлгі мен оның айналасындағы ерітінді мен қатты фаза арасындағы өзара әрекеттесу пайда болуы мүмкін. Мысалы, «қоқыс жинаушылар» ковалентті емес өзара әрекеттесулер арқылы бір немесе екі жақты ДНҚ-ны байланыстыра алады және бұл себептер санын азайту арқылы оқшаулау мен тазартуға кедергі келтіруі мүмкін, бұл ПТР реакциясы ыдысының
Жалпы, ПТР ингибиторлары дененің көптеген сұйықтықтары мен реагенттері, клиникалық диагностикалық сынақтарда (зәр шығару, гемоглобин және гепарин), диеталық қоспалар (органикалық компоненттер, гликоген, май, қап2 + иондары) және қоршаған ортадағы компоненттер (фенолдар, ауыр металдар)

Көп ұзартылған ПТР ингибиторларын бактерияларда және эукариотикалық жасушаларда, мақсатты емес ДНҚ-да, мақсатты емес ДНҚ, тіндердің матрицаларынан және қолғап пен пластмассалардан жасалған дәрменсіз макромолектерден табуға болады. Экстракция кезінде немесе одан кейінгі нуклеин қышқылдарын тазарту - ПТР ингибиторларын жоюдың таңдаулы әдісі.
Бүгінгі таңда әр түрлі автоматтандырылған экстракция жабдықтары көптеген қолмен протоколдарды алмастыра алады, бірақ 100% қалпына келтіру және / немесе нысандарды тазарту ешқашан қол жеткізілмеген. Ықтимал ингибиторлар әлі де тазартылған нуклеин қышқылдарында болуы мүмкін немесе бұрын күшіне енген болуы мүмкін. Ингибиторлардың әсерін азайту үшін әртүрлі стратегиялар бар. Тиісті полимеразаны таңдау ингибиторлардың белсенділігіне айтарлықтай әсер етуі мүмкін. ПТР ингибирлеуді азайтудың басқа дәлелденген әдістері полимеразаның концентрациясын ұлғайту немесе BSA сияқты қоспаларды қолдану.
ПТР реакцияларын тежеуге ішкі процесстің сапасын бақылау арқылы көрсетуге болады (IPC).
Этанол, edta, chetab, getab, getab, geta, gucl, gusocn, gusopan, sds, gusopanol және фенол сияқты барлық реагенттер мен басқа шешімдерді алып тастау керек. Олардың концентрациясына байланысты олар ПТР-ны белсендіре немесе тежеуі мүмкін.