ПТР реакцияларындағы интерференция факторлары

ПТР реакциясы кезінде кейбір кедергі келтіретін факторлар жиі кездеседі.
ПТР-ның өте жоғары сезімталдығына байланысты ластану ПТР нәтижелеріне әсер ететін ең маңызды факторлардың бірі болып саналады және жалған оң нәтижелер беруі мүмкін.
Жалған-теріс нәтижелерге әкелетін әртүрлі көздер де бірдей маңызды. Егер ПТР қоспасының бір немесе бірнеше маңызды бөлігі немесе күшейту реакциясының өзі тежелсе немесе араласса, диагностикалық талдау кедергі келтіруі мүмкін. Бұл тиімділіктің төмендеуіне және тіпті жалған-теріс нәтижелерге әкелуі мүмкін.
Тежелуден басқа, үлгіні дайындау алдында тасымалдау және/немесе сақтау жағдайларына байланысты нысаналы нуклеин қышқылының тұтастығының жоғалуы мүмкін. Атап айтқанда, жоғары температура немесе жеткіліксіз сақтау жасушалар мен нуклеин қышқылдарының зақымдалуына әкелуі мүмкін. Жасуша мен тіндердің бекітілуі және парафиннің енуі ДНҚ фрагментациясының белгілі себептері және тұрақты мәселе болып табылады (1 және 2 суреттерді қараңыз). Мұндай жағдайларда тіпті оңтайлы оқшаулау мен тазарту да көмектеспейді.

1-сурет | Иммобилизацияның ДНҚ тұтастығына әсері
Агарозды гель электрофорезі мәйіттерді аутопсиялаудың парафинді кесінділерінен бөлініп алынған ДНҚ сапасының айтарлықтай өзгеретінін көрсетті. Фиксация әдісіне байланысты экстракттарда орташа фрагмент ұзындығы әртүрлі ДНҚ болды. ДНҚ тек табиғи мұздатылған үлгілерде және буферленген бейтарап формалинде фиксацияланған кезде ғана сақталды. Күшті қышқылды Буэн фиксаторын немесе буферленбеген, құмырсқа қышқылы бар формалинді қолдану ДНҚ-ның айтарлықтай жоғалуына әкелді. Қалған фракция өте фрагменттелген.
Сол жақта фрагменттердің ұзындығы килобаза жұптарымен (кбп) көрсетілген.

2-сурет | Нуклеин қышқылы нысаналарының тұтастығын жоғалту
(a) Екі тізбектегі 3′-5′ саңылау нысана ДНҚ-ның үзілуіне әкеледі. ДНҚ синтезі әлі де кішкентай фрагментте жүреді. Дегенмен, егер ДНҚ фрагментінде праймердің күйдіру орны болмаса, тек сызықтық амплификация орын алады. Ең қолайлы жағдайда фрагменттер бір-бірін қайта қанықтыруы мүмкін, бірақ өнімділік аз болады және анықтау деңгейінен төмен болады.
(b) Негізінен депуринация және тимидин димерінің түзілуіне байланысты негіздердің жоғалуы Н-байланыстар санының азаюына және Tm-нің азаюына әкеледі. Ұзартылған жылыну фазасында праймерлер матрицалық ДНҚ-дан еріп кетеді және онша қатаң емес жағдайларда да күйдірілмейді.
(c) Көршілес тимин негіздері TT димерін құрайды.
Молекулалық диагностикада жиі кездесетін тағы бір кең таралған мәселе - фенол-хлороформ экстракциясымен салыстырғанда нысаналы нуклеин қышқылдарының оңтайлы емес бөлінуі. Төтенше жағдайларда бұл жалған теріс нәтижелермен байланысты болуы мүмкін. Қайнату лизисі немесе жасуша қалдықтарын ферментативті түрде қорыту арқылы көп уақытты үнемдеуге болады, бірақ бұл әдіс көбінесе нуклеин қышқылының жеткіліксіз бөлінуіне байланысты ПТР сезімталдығының төмендеуіне әкеледі.

Күшейту кезінде полимераза белсенділігінің тежелуі

Жалпы алғанда, ингибирлеу ПТР нәтижелерінің оңтайлы емес болуына әкелетін барлық факторларды сипаттау үшін контейнерлік тұжырымдама ретінде қолданылады. Қатаң биохимиялық мағынада ингибирлеу ферменттің белсенділігімен шектеледі, яғни ол ДНҚ полимеразасының белсенді орталығымен немесе оның кофакторымен (мысалы, Taq ДНҚ полимеразасы үшін Mg2+) әрекеттесу арқылы субстрат-өнімнің түрленуін азайтады немесе болдырмайды.
Үлгідегі компоненттер немесе реагенттері бар әртүрлі буферлер мен экстракттар ферментті тікелей тежеуі немесе оның кофакторларын (мысалы, ЭДТА) ұстап қалуы мүмкін, осылайша полимеразаны белсенді емес етеді және өз кезегінде ПТР нәтижелерінің төмендеуіне немесе жалған теріс болуына әкеледі.
Дегенмен, реакция компоненттері мен нысанадан тұратын нуклеин қышқылдары арасындағы көптеген өзара әрекеттесулер «ПТР ингибиторлары» деп те аталады. Жасушаның тұтастығы оқшаулау арқылы бұзылғаннан және нуклеин қышқылы бөлініп шыққаннан кейін, үлгі мен оны қоршаған ерітінді мен қатты фаза арасында өзара әрекеттесу орын алуы мүмкін. Мысалы, «қоқыс жинаушылар» ковалентті емес өзара әрекеттесулер арқылы бір немесе екі тізбекті ДНҚ-ны байланыстыра алады және ақырында ПТР реакция ыдысына жететін нысаналар санын азайту арқылы оқшаулау мен тазартуға кедергі келтіре алады.
Жалпы, ПТР ингибиторлары клиникалық диагностикалық сынақтар үшін қолданылатын көптеген дене сұйықтықтары мен реагенттерде (зәрдегі мочевина, қандағы гемоглобин және гепарин), тағамдық қоспаларда (органикалық компоненттер, гликоген, май, Ca2+ иондары) және қоршаған ортадағы компоненттерде (фенолдар, ауыр металдар) болады.

ПТР ингибиторларын бактериялар мен эукариоттық жасушаларда, нысана емес ДНҚ-да, тін матрицаларының ДНҚ-мен байланысатын макромолекулаларында және қолғаптар мен пластмассалар сияқты зертханалық жабдықтарда жиі кездестіруге болады. Экстракция кезінде немесе одан кейін нуклеин қышқылдарын тазарту ПТР ингибиторларын жоюдың ең қолайлы әдісі болып табылады.
Бүгінгі таңда әртүрлі автоматтандырылған экстракция жабдықтары көптеген қолмен басқарылатын хаттамаларды алмастыра алады, бірақ нысаналарды 100% қалпына келтіру және/немесе тазарту ешқашан қол жеткізілген емес. Әлеуетті ингибиторлар тазартылған нуклеин қышқылдарында әлі де болуы мүмкін немесе күшіне енген болуы мүмкін. Ингибиторлардың әсерін азайту үшін әртүрлі стратегиялар бар. Тиісті полимеразаны таңдау ингибитор белсенділігіне айтарлықтай әсер етуі мүмкін. ПТР ингибирлеуін азайтудың басқа дәлелденген әдістері - полимераза концентрациясын арттыру немесе BSA сияқты қоспаларды қолдану.
ПТР реакцияларының тежелуін ішкі процестің сапасын бақылау (ІПБ) арқылы көрсетуге болады.
Нуклеин қышқылының изолятынан этанол, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, изопропанол және фенол сияқты барлық реагенттерді және экстракция жинағындағы басқа ерітінділерді мұқият жуу қадамымен алып тастау керек. Концентрациясына байланысты олар ПТР-ны белсендіруі немесе тежеуі мүмкін.